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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷硝化作用呈现组学、LC-MS/MS磷硝化作用位点研究技术服务。
日文一级标题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
中文字幕主题词：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
客服单位名称：山东大学
理论研究涂料：拟南芥侧根
拜谱供应科技：磷酸性反应遮盖组学、LC-MS/MS磷酸性反应位点分享
实验一个构想：
PART 01 探析毕竟
01、发展素力促VIK的磷硝化作用以至于转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷过酸球核苷酸类物质析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 萌发素利于VIK的磷酸性反应以至于转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷碱化实验设计。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酵母菌双交配解析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶互补性激光散斑进行实验（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体外磷碱化实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。时时按量PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素卫星信号乐观政策调控 LR 发育成熟
凭借剖析两位VIK T-DNA导入突然变化体（vik-2和vik-3），出现与野生穿山甲型相较于，突然变化体的LR硬度计算、LR原基（LRP）和已大的LR偏态降低，尤其要是vik-2（图2）。相对来说，过传达VIK的转表观遗传主茎主要表现出LR硬度计算增长。显然，在vik-2突然变化体背静下传达VIK的转表观遗传主茎回复了LR大障碍。种子发芽素进行处理试验反映，vik-2突然变化体对种子发芽素诱惑的LR大生理反应减小，反映VIK在种子发芽素改善LR大中充分调动重中之重反应。 
图2 VIK介导的植物的生长素信息环路正在向调节LR的成长
03、VIK 与ERF13 对其进行生物学可视化交互
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双原子核荧光互补原理 （BiFC）和免疫检测共发展科学试验（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13间接功效
04、VIK以正负极馈的方试房产调控ERF13磷过酸
通过磷酸性反应核蛋白组学讲解，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点甲基化感觉显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以双面馈办法磷碱化ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷酸性反应推进ERF13溶解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过身体外试验性和身体试验性，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模以和磷酸降解突变的体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚受损细胞导航定位讲解表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷硝化作用速度了ERF13分解
06、VIK 介导的 ERF13 磷硝化作用改善 LR 的产生
分析进几步浅议了VIK干预的ERF13挥发在侧根（LR）成长中的帮助。采用较的有差异转DNA蕨类观赏常绿藤本植物系的LR表型，挖掘过表述ERF13治理和改善了LR的存在，在vik变动体中此类治理和改善帮助明显增强，而在过表述YFP-VIK的情况下此类治理和改善帮助下降（图6）。不但，较ERF13的的有差异磷过酸模似和磷酸光降解基因变异体的过表述蕨类观赏常绿藤本植物系，挖掘ERF132A-Myc（磷酸光降解）的蕨类观赏常绿藤本植物系LR存在比较少，而ERF132D-Myc（磷过酸模似）的蕨类观赏常绿藤本植物系LR存在略多。这一些成果证明，VIK介导的ERF13磷过酸和挥发加速了LR的存在。 
图6 VIK介导的ERF13磷酸性反应推进LR的突然出现
07、VIK在侧根成长发育中磷碱化并不稳定性LBD18核蛋白
可以通过进行分析几个VIK T-DNA插入图变化性率体（vik-2和vik-3），挖掘与野山型相较于，变化性率体的侧根（LR）溶解度、LR原基（LRP）和已发肓的LR更为明显限制，尤为是vik-2（图7）。反而，过得出结论VIK的转DNA茎叶成绩出LR溶解度提升。然而，在vik-2变化性率体背景图下得出结论VIK的转DNA茎叶完全恢复了LR发肓障碍。植物产生素外理實驗得出结论，vik-2变化性率体对植物产生素帮助的LR发肓反响变弱，得出结论VIK在植物产生素管控LR发肓中起着重要角色。 
图7 VIK 在LR构成时候中会直接磷过酸和增强LBD18球蛋白
PART 02 文章内容工作小结
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷碱化蛋白酶质组学深入分析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的出现素走势上下调整侧根建立
PART 03 拜谱总结ppt
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的核营养物质组学、掩盖核营养物质组学、消化吸收组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—较高高度DIA·磷硝化作用表达组，采用创新丰度技艺+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现小动物子样板10w+、树种子样板5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
考生期刊论文：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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